Frontiers Trasformazione strutturale bio-catalitica di steroide anticancro, drostanolone enantato

Trasformazione strutturale bio-catalitica dello steroide anti-cancro, drostanolone enantato con Cefalosporium afidicola e Fusarium Lini, e valutazione del potenziale citotossico dei suoi metaboliti contro alcune linee cellulari tumorali

Alla ricerca di agenti anticancro selettivi ed efficaci, otto metaboliti di steroide anticancro, drostanolone enanthate (1), sono stati sintetizzati attraverso biotrasformazione microbica. Enzimi come reduttasi, ossidasi, deidrogenasi e idrolasi da Cefalosporium afidicola, e Fusarium Lini erano probabilmente coinvolti nella biotrasformazione di 1 in nuovi metaboliti a pH 7.0 e 26 ° C, producendo cinque nuovi metaboliti, 2α-metil-3α, 14α, 17β-trihidrossi-5α-Androstane (2), 2α-metil-7α-idrossi-5α-androstan-3,17-dione (3), 2-methylandrosta-11α-hydroxy-1, 4-diene-3,17-dione (6), 2-methylandrosta-14α-idrossi-1,4-diene-3,17-dione (7) e 2-metil-5α-androsta-7α-idrossi-1-ene-3,17-dione (8), insieme a tre metaboliti noti, 2α-metil-3α, 17β-diidrossi-5α-Androstane (4), 2-methylandrosta-1, 4-diene-3,17-dione (5) e 2α-metil-5α-androsta-17β-idrossi-3-one (9), sulla base dei dati di NMR e HREI-MS e tecniche di diffrazione dei raggi X a cristallo singolo. È interessante notare, C. Afidicola e F. Lini sono stati in grado di catalizzare l’idrossilazione solo in posizioni alfa di 1. Composti 1–9 ha mostrato un variabile grado di citotossicità contro HeLa (carcinoma cervicale umano), PC3 (carcinoma prostatico umano), H460 (carcinoma polmonare umano) e linee cellulari tumorali HCT116 (carcinoma del colon umano). È interessante notare che i metaboliti 4 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 49.5 ± 2.2 μm), 5 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 39.8 ± 1.5 μm), 6 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 40.7 ± 0.9 μm), 7 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 43.9 ± 2.4 μm), 8 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 19.6 ± 1.4 μm) e 9 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 25.1 ± 1.6 μm) è risultato essere più attivo contro la linea cellulare del cancro HeLa rispetto al substrato 1 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 54.7 ± 1.6 μm). Allo stesso modo, metaboliti 2 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 84.6 ± 6.4 μm), 3 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 68.1 ± 1.2 μm), 4 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 60.4 ± 0.9 μm), 5 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 84.0 ± 3.1 μm), 6 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 58.4 ± 1.6 μm), 7 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 59.1 ± 2.6 μm), 8 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 51.8 ± 3.4 μm) e 9 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 57.8 ± 3.2 μm) sono stati identificati come più attivi contro la linea cellulare tumorale PC-3 rispetto al substrato 1 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 96.2 ± 3.0 μm). Metabolita 9 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 2.8 ± 0.2 μm) ha anche mostrato una potente attività antitumorale contro la linea cellulare tumorale HCT116 rispetto al substrato 1 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 3.1 ± 3.2 μm). Inoltre, composti 1–7 non ha mostrato citotossicità contro la linea cellulare normale 3T3, mentre i composti 8 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 74.6 ± 3.7 μm) e 9 (CIRCUITO INTEGRATO50 = 62.1 ± 1.2 μm) è risultato essere debolmente citotossico.

introduzione

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La trasformazione microbica è uno degli approcci più importanti per la trasformazione strutturale di varie classi di composti organici. Questa tecnica è stata impiegata con successo in chimica verde, io.e. I programmi di scoperta e sviluppo del farmaco, fornendo un’eccellente fonte di composti intorno alle strutture di base, seguita da screening per varie attività biologiche. In diversi casi, la trasformazione microbica è stata utilizzata come strumento importante per le conversioni di regione, chemioterapia e stereo-selettiva di composti organici che sono difficili da raggiungere con metodi convenzionali (Holland e Weber, 2000; Fernandes et al., 2003; Mihovilovic et al., 2003; Yildirim et al., 2003; Bartmanska et al., 2005; Borges et al., 2009; Choudhary et al., 2011; Ravindran et al., 2012). A causa della natura inattiva dello scheletro di idrocarburi degli steroidi, sono spesso difficili da derivati ​​con metodi sintetici convenzionali. Pertanto, la trasformazione microbica viene spesso utilizzata per l’alterazione strutturale degli steroidi. La presenza di sistemi enzimatici del citocromo P450 nei funghi, rende la biocatalisi delle cellule intere uno strumento efficiente per l’idrossilazione stereo-e rego-specifica (Choudhary et al., 2005a; Tong e Dong, 2009; Kristan e Rižner, 2012; Baydoun et al., 2014).

Drostanolone e i suoi derivati ​​degli esteri, come il drostanolone propionato, il drostanolone pentanoato e il drostanolone enanthate (1) sono steroidi anabolici-androgeni (AASS) usati dagli atleti per rafforzare i loro muscoli senza guadagnare grasso. Inoltre, il drostanolone e i suoi derivati ​​degli esteri hanno la capacità di inibire la produzione di estrogeni. L’estere propionato di Drostanolone viene utilizzato anche per il trattamento del carcinoma mammario, con il marchio di Masteron (Chowdhury et al., 1976; Clavel et al., 1982; Marinov et al., 1986; Vardar et al., 2002; Bahrke e Yesalis, 2004).

Il cancro è attualmente riconosciuto come una grande sfida di salute pubblica. I tumori sono la seconda principale causa di morte negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Secondo l’Organizzazione mondiale della sanità (OMS), la prevalenza del cancro è superiore a 6 milioni di casi all’anno. Le cellule tumorali hanno un alto tasso di proliferazione. Si sono diffusi rapidamente nel sistema vivente e possono sopravvivere contro i chemioterapici forti e gli agenti dannosi del DNA. Allo stesso modo, i farmaci citotossici hanno molti effetti avversi sulle cellule normali e quindi il loro uso nella chemioterapia del cancro è una sfida terapeutica. Per questo motivo, lo sviluppo di agenti chemioterapici sicuri, efficaci e selettivi è urgentemente necessario contro vari tumori (Munoz-Pinedo et al., 2012; Su et al., 2015; Swadogo et al., 2015; Rebecca et al., 2016).

Il cancro al seno è uno dei tumori più comuni in 140 paesi del mondo. È una delle principali cause di morte legata al cancro nelle femmine di tutto il mondo, caratterizzata dalla crescita anormale delle cellule nei lobuli al seno o nei dotti con l’alto tasso di proliferazione (Hanahan e Weinberg, 2000; Ferlay et al., 2015).

Il carcinoma cervicale è il secondo tumore più predominante nelle femmine di tutto il mondo, dopo il carcinoma mammario. La causa principale del carcinoma cervicale è la formazione di cellule maligne nei tessuti della cervice (Wang et al., 2013; Hafiza e Latifah, 2014; Pariente et al., 2016). La linea cellulare del cancro HeLa, ottenuta dalle cellule tumorali cervicali umane, è un modello cellulare comune per valutare il potenziale citotossico dei composti di prova.

Il cancro alla prostata è il secondo tumore leader nel mondo maschile dopo il cancro del bronco e la terza causa più comune di morte per il cancro. È la ragione più comune di malignità negli uomini. La sua incidenza aumenta con l’età, più comune di età superiore ai 50 anni (Henry e Omahony, 1999; De-Bono et al., 2010; Wenbin et al., 2015). La linea cellulare tumorale PC-3, ottenuta dalle cellule tumorali della prostata maschile, è un modello ampiamente usato per studiare la tossicità dei composti di prova.

Il cancro al polmone è un cancro molto diffuso tra gli uomini negli Stati Uniti dalla metà degli anni ’50 e tra le donne, dalla fine degli anni ’80. È una delle principali cause di morte legata al cancro. Il carcinoma polmonare è principalmente attribuito al fumo (Travis et al., 2002; Villanti et al., 2013; Mishra et al., 2016). La linea cellulare tumorale H460, ottenuta dalle cellule tumorali polmonari umane (subline metastatiche linfogene del carcinoma polmonare a cellule di grandi dimensioni), sono spesso utilizzate per valutare la citotossicità dei composti di prova.

Dopo i tumori del seno, dei polmoni e della prostata, il cancro del colon è il quarto cancro più diffuso in tutto il mondo. È il cancro che si trova nella frequenza approssimativamente uguale nei maschi e nelle femmine. È la seconda causa più comune di decessi legati al cancro nei paesi occidentali (Levin et al., 2008; Andre et al., 2009; Ahearn et al., 2012). La linea cellulare tumorale HCT116, ottenuta dalle cellule tumorali del colon umano, è comunemente usata per valutare la citotossicità dei composti di prova.

In continuazione dei nostri studi sulla trasformazione fungina di steroidi bioattivi (Choudhary et al., 2005b, C, 2007, 2010; Ahmad et al., 2014; Siddiqui et al., 2017), abbiamo sintetizzato analoghi di drostanolone enanthate (1) attraverso la sua trasformazione con Cefalosporium afidicola, e Fusarium Lini. Metaboliti 2–9, così come il substrato 1, sono stati valutati contro HeLa (carcinoma cervicale), PC-3 (carcinoma prostatico), H460 (carcinoma polmonare), HCT116 (carcinoma del colon) e 3T3 (normali cellule di mouse fibroblasti), usando un test a base di cellule ad alto rendimento, il più Metodo di laboratorio efficiente e conveniente, il test MTT per prevedere la risposta dei composti di test nelle neoplasie in cui hanno mostrato specificità contro le cellule tumorali. Questo studio ha quindi identificato i metaboliti anti-cancro di drostanolone enanthate (1) per ulteriori studi.

Materiali e metodi

Analisi strumentale

Cromatografia a strato sottile (TLC) (gel di silice, 20 × 20, 0.25 mm di spessore, PF254, Merck, Germania) è stato utilizzato per l’analisi del grado di trasformazione e purezza. Cromatografia su colonna in gel di silice (70–230 mesh, E. Merck, Germania) è stato usato per la purificazione iniziale dei metaboliti. Inoltre, il riciclaggio della fase inversa preparativa (Jai LC-908W, Giappone), dotato di YMC L-80 (4-5 μm, 20–50 mm I.d.), è stato usato per la purificazione finale dei metaboliti. Le strutture di metaboliti sono state chiarite con l’aiuto di spettri H- (400, 500 e 600 MHz) e 13 C-NMR (100, 125 e 150 MHz), che sono stati registrati sugli spettrometri Bruker Avance-NMR (Francia) In CD3OD, CD3COCD3 o dmso-d6. Gli spettri HREI-MS e IR sono stati eseguiti su JEOL JMS-600H (Giappone) (analizzatore di massa del settore magnetico a doppia focalizzazione) spettrometro di massa (EI, ionizzazione a impatto elettronico) e spettrofotometro Bruker Vector 22 FT-IR, rispettivamente. Le rotazioni ottiche dei metaboliti sono state registrate su Polarimeter Jasco P-2000 (Giappone). Evolution 300 Spettrofotometro visibile UV è stato utilizzato per registrare gli spettri UV. I punti di fusione dei prodotti trasformati sono stati misurati utilizzando lo strumento Buchi M-560 (Svizzera). I dati di diffrazione dei raggi X a cristallo singolo sono stati raccolti sul diffrattometro Bruker apexii d8 di venture.54178 Å). Le intensità di riflessione sono state integrate utilizzando il software Saint. La correzione dell’assorbimento è stata eseguita su multi-scan e la struttura è stata risolta dal programma Shextl (Gerlier e Thomasset, 1986; Sheldrick, 2008; Spek, 2009).

Culture microbiche

Cultura microbica di C. Afidicola ATCC 28300 e F. Lini NRRL 2204 sono stati ottenuti rispettivamente dalla American Type Culture Collection (ATCC) e Northern Regional Research Laboratories (NRRL). Le colture sono state coltivate su inclinazione di sabourauud destrosio (SDA) e mantenute a 4 ° C.

Preparazione dei media

Quattro litri di media per la crescita di C. Afidicola ATCC-28300 è stato preparato mescolando 200 g di glucosio, 4 g di KH2Po4, 8 g di glicina, 4 g di KCl, 8 g di MGSO4.7h2O e 8 ml di oligoelementi in 4 L di acqua distillata. Allo stesso modo, sono stati preparati quattro litri di media F. Lini NRRL 2204 mescolando 40 g di glucosio, 20 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di kH2Po4, 20 g di NaCl e 40 ml di glicerolo in 4 L di acqua distillata.

Fermentazione di drostanolone enanthate (1) con C. Afidicola ATCC 28300 e F. Lini NRRL 2204

Mezzo per la crescita di C. Afidicola e F. Lini è stato preparato mescolando ingredienti sopra menzionati in 4 L di acqua distillata per ciascun fungo, che è stato quindi erogato equamente in 40 boccette di Erlenmeyer di 250 ml (100 ml in ogni pallone). Tutte queste boccette sono state autoclavate a 121 ° C e sono state inoculate con inclinazioni SDA di C. Afidicola ATCC 28300 e F. Lini NRRL 2204 in condizioni sterilizzate. Queste colture fungine contenenti boccette sono state lasciate sullo shaker rotante (121 rpm) a 26 ± 2 ° C per 3-4 giorni per ottenere la massima crescita di C. Afidicola e F. Lini. Composto 1 (1 g) è stato sciolto in 20 ml di acetone per ciascun fungo ed è stato distribuito 0.5 ml in ogni pallone, e di nuovo posizionato su rotaggio shaker per 12 giorni. Sono stati anche preparati un controllo negativo (medio + coltura fungina), nonché un controllo positivo (medio + substrato) 1, rispettivamente. Dopo l’incubazione di 12 giorni, tutte le boccette sono state filtrate ed estratte con 20 L di diclorometano (DCM), la fase organica è stata separata e quindi è stata evaporata a pressione ridotta sull’evaporatore rotante. Questo ha prodotto 1.5 g di greggio solido giallastro pallido. Questo materiale grezzo è stato frazionato su cromatografia su colonna in gel di silice per eluizione con esani a gradiente e sistemi di solvente acetone. La cromatografia a colonna ha prodotto quattro frazioni principali (1-4), che sono state quindi purificate riciclando HPLC. Metaboliti 2 (tR = 16 min, 8 mg, 0.8%), 3 (tR = 19 min, 11 mg, 1.1%), 4 (tR = 17 min, 35 mg, 3.5%), 5 (tR = 23 min, 42 mg, 4.2%), 6 (tR = 20 min, 9 mg, 0.9%), 7 (tR = 21 min, 12 mg, 1.2%), e 9 (tR = 18 minuti, 5 mg, 0.5%) sono stati purificati dalle frazioni 1-7, rispettivamente, attraverso il riciclaggio di fase inversa HPLC usando l’acqua di metanolo come sistema di solvente (MEOH: H2O; 70: 30). Considerando che il metabolita 8 è stato ottenuto dalla frazione 8 attraverso il riciclaggio di fase normale HPLC (tR = 32 min, CHCL3: Meoh; 95: 5, 7.5 mg, 0.75%).

2α-metil-3α, 14α, 17β-trihidrossi-5α-Androstane (2)

Solido bianco; m. p.: 274–375 ° C; [α] d 25 = −14.8 ((c 0.0046, cap3OH); IR (CHCL3): υmax (CM −1), 3531 (OH), 3423 (OH); HREI-MS: m/z 322.2517 [M +], (calcd. 322.2508, c20H34O3); EI-MS: m/z (%); 322.2 [M +] (2), 304.2 (74), 271.2 (36), 264.2 (82), 110.0 (99); 1 H-NMR (CD3OD, 600 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 150 MHz): Tabella 1.

Tabella 1. 13 Dati di spostamento chimico C- e 1 H-NMR (J e W1/2 in Hz) di composti 1–3 (Δ ppm).

2α-metil-7α-idrossi-5α-androstan-3,17-dione (3)

Solido bianco; m. p.: 230–234 ° C; [α] d 25 = −34.1 (c 0.0017, cap3OH); IR (CHCL3): υmax (CM −1), 3436 (O-H), 1711 (c = O); HREI-MS: m/z 318.2192 [M +] (calcd. 318.2195, c20H30O3); EI-MS m/z (%): 318.1 [M +] (7), 300.1 (36), 147.1 (16.2), 136.1 (100); 1 H-NMR (CD3OD, 400 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 150 MHz): Tabella 1.

2α-metil-3α, 17β-diidrossi-5α-Androstane (4)

Solido bianco; m. p.: 242–245 ° C; [α] d 25 = +34.1 (c 0.0077, cap3Oh), ir (chcl3): υmax (CM −1), 3315 (OH); HREI-MS: m/z 306.2553 [M +] (calcd. 306.2559, c20H34O2); EI-MS m/z (%): 306.3 [M +] (75), 291.2 (61), 229.2 (98), 179.1 (93), 121.1 (100); 1 H-NMR (CDCL3, 600 MHz): Tabella 2; 13 C-NMR (CDCL3, 150 MHz): Tabella 2.

Tavolo 2. 13 Dati di spostamento chimico C- e 1 H-NMR (J e W1/2 in Hz) di composti 46 (Δ ppm).

2-methylandrosta-1,4-diene-3,17-dione (5)

Solido bianco; m. p.: 198–202 ° C; UV λmax: 229 nm (CH3Oh, log ε 2.04); [α] d 25 = +39.0 ((c 0.018, cap3OH); IR (CHCL3): υmax (CM −1), 1737 (C = O allungamento), 1665, 1625 (α, β-non saturo di chetone); HREI-MS: m/z 298.1944 [M +] (calcd. 298.1933, c20H26O2); EI-MS m/z (%): 298.0 [M +] (55), 280.0 (8), 197.9 (28), 169.9 (23), 152.9 (99), 136.0 (100); 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz): Tabella 2; 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Tabella 2.

2-methylandrosta-11α-idrossi-1,4-diene-3,17-dione (6)

Solido bianco; m. p.: 230–234 ° C; UV λmax: 248 nm (CH3Oh, log ε 6.91); [α] d 25 = −21 (c 0.0012, cap3OH); IR (CHCL3): υmax (CM −1), 3436 (OH), 1736 (c = O), 1661, 1621 (α, β-non saturo di chetone); HREI-MS: m/z 314.1897 [M +] (calcd. 314.1882, c20H26O3); EI-MS m/z (%): 314.2 [M +] (45), 296.2 (15), 148.1 (11), 136.1 (100), 135.1 (50), 121.1 (16); 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 2; 13 C-NMR (CD3OD, 150 MHz): Tabella 2.

2-methylandrosta-14α-idrossi-1,4-diene-3,17-dione (7)

Solido bianco; m. p.: 224–228 ° C; UV λmax: 248 nm (CH3Oh, log ε 6.98); [α] d 25 = −52 (c 0.0014, cap3OH); IR (CHCL3): υmax (CM −1), 3468 (OH), 1727 (c = O), 1666, 1628 (α, β-non saturo di chetone); HREI-MS: m/z 314.1861 [M +] (calcd. 314.1882, c20H26O3); EI-MS m/z (%): 314.2 [M +] (57), 286.1 (8), 136.1 (62), 135.1 (100), 105.0 (23). 1 H-NMR (CD3OD, 600 MHz): Tabella 3; 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): Tabella 3.

Tabella 3. 13 Dati di spostamento chimico C- e 1 H-NMR (J e W1/2 in Hz) di composti 79 (Δ ppm).

2-methylandrosta-7α-hydroxy-1-ene-3,17-dione (8)

Solido bianco; m. p.: 250–256 ° C; UV λmax: 230 nm (CH3Oh, log ε 6.32) [α] d 25 = + 35.1 (c 0.0077, cap3Oh), ir (chcl3): υmax (CM −1), 3417 (OH); 1736 (c = o); HREI-MS: m/z 316.2042 [M +] (calcd. 316.2038, c20H28O3); EI-MS m/z (%): 316.2 [M +] (88), 270.2 (50), 159.1 (26.6), 136.1 (59.1), 123.1 (65.4); 1 H-NMR (CD3OD, 400 MHz): Tabella 3; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 3.

2α-metil-5α-androstane-17β-idrossi-3-one (9)

Solido bianco; m. p.: 151–153 ° C; [α] d 25 = +16.2 (c 0.00065, cap3Oh), ir (chcl3): υmax (CM −1), 3437 (OH); HREI-MS: m/z 304.2403 [M +] (calcd. 304.2402, c20H32O2); EI-MS m/z (%): 304.3 [M +] (63.7), 245.2 (84), 138.1 (18), 95.1 (24), 91.1 (100); 1 H-NMR (CD3OD, 400 MHz): Tabella 3; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 3.

Protocollo sperimentale per la citotossicità

La citotossicità dei campioni è stata misurata contro HeLA (carcinoma cervicale umano ATCC CCL-2), PC-3 (carcinoma prostatico umano ATCC CRL-1435), NCL-H460 (carcinoma polmonare umano ATCC HTB-177), HCT116 (carcinoma del colon umano ATCC CCL-247) e 3T3 (Control Fibroblast Normale ATCC CRL-1658) Linee cellulari utilizzando il dosaggio MTT standard. Le linee cellulari sono state coltivate in supporti DMEM F12, integrati con FBS al 10% con un CO del 5%2 Atmosfera a 37 ° C in un incubatore.

Il dosaggio colorimetrico MTT [3- (4, 5-dimetil tiazol-2yl) -2, bromuro di 5-difenil tetrazolio] è stato usato per la valutazione dell’attività metabolica cellulare. In questo test, il MTT giallo è ridotto a Formazon viola nei mitocondri delle cellule viventi (Gerlier e Thomasset, 1986). Più le cellule viventi, più il colore e quindi più assorbanza si osserva dal colorimetro (Fesahat et al., 2015). Abbiamo usato questo metodo per analizzare l’effetto dei nostri prodotti trasformati sulla citotossicità cellulare contro le cellule tumorali. Circa 10.000 celle di ciascuna linea cellulare (HeLa, PC3, H460, tumori HCT116 e 3T3 normali) sono state seminate in piastre da 96 pozzetti. Dopo aver raggiunto la confluenza dell’80-90%, sono stati trattati con varie concentrazioni di composti (25, 50, 75, 100 e 200 μM) per 24 ore. Tutti i composti sono stati sciolti in DMSO sterile per creare una soluzione madre di 200 mm. La soluzione è stata filtrata e le diluizioni seriali sono state fatte in mezzo di crescita. 600 μl di ciascuna diluizione sono stati usati per trattare 3 pozzi (triplicato di ciascuno) di 96 piastre di pozzo I.e., 200 μl ciascuno. Ogni esperimento è stato eseguito in tre replicati biologici. MTT è stato aggiunto e incubato per 4 ore. Dopo la rimozione di MTT, i cristalli di formazon viola sono stati sciolti in DMSO e la lettura è stata osservata a 540 e 570 nm per le cellule normali e tumorali, rispettivamente. Il lettore multiskan dà λmax a 540 nm in cellule fibroblasti 3T3 trattate con DMSO (che sono più confluenti nella morfologia) mentre in caso di cellule tumorali, 570 nm dà λmax (Bonmati-Carrion et al., 2013; Danihelová et al., 2013). In questo esperimento sono state utilizzate una vasta gamma di linee cellulari di carcinoma epiteliale in cui il cisplatino era un farmaco comune. Si prende di mira il DNA, interferisce con la divisione cellulare durante la mitosi e induce l’apoptosi (Eastman, 1999). CIRCUITO INTEGRATO50 I valori sono stati calcolati per determinare la concentrazione minima richiesta per uccidere il 50% delle cellule.

% I n h i b i t i o n = 100 – (a t – a b) (a c – a b) × 100 % c e l l s u r v i v a l = (a t – a b) (a c – a b) × 100

In = Valore di assorbanza del composto di test

Ab = Valore di assorbanza di vuoto

AC = Valore di assorbanza del controllo

Risultati e discussione

Struttura chiacchiere

Fermentazione di drostanolone enanthate (1) (C27H44O3 [M +] AT m/z 416.4), (foglio di dati 1) con C. Afidicola e F. Lini viene segnalato qui. Incubazione di 1 insieme a C. Afidicola forniti sei metaboliti 2–7 (Figura 1), mentre con F. Lini ha prodotto cinque metaboliti 3–5, e 89 (Figura 2). Descrizioni di dettagli di nuovi metaboliti 2, 3, 6, 7, e 8 sono narrati di seguito.

Figura 1. Biotrasformazione del drostanolone enanthate (1) insieme a Cefalosporium afidicola.

figura 2. Biotrasformazione del drostanolone enanthate (1) insieme a Fusarium Lini.

Metabolita 2 è stato isolato come cristalli bianchi. La formula molecolare C20H30O3 era basato su HREI-MS che mostrava il [m +] a m/z 322.2517 (calcd. 322.2508, c20H34O3), suggerendo l’aggiunta di tre idrogeno e un atomo di ossigeno, riduzione del carbonile chetonico C-3 e scissione idrolitica della catena laterale di eptanoato nel substrato 1. L’assorbanza IR a 3.531 e 3.423 cm −1 erano dovute alla presenza di gruppi idrossilici. Lo spettro 1 H-NMR ha mostrato un segnale di protone metita aggiuntivo a Δ 3.69 (Tabella 1) (Scheda dati 2). I segnali per la catena laterale di eptano sono stati trovati anche mancanti in 1 spettro H-NMR di composto 2. Lo spettro di 13 c-NMR ha mostrato segnali per un nuovo carbonio metito a Δ 71.4 e un nuovo carbonio quaternario a Δ 84.8. I segnali di carbonio per la catena di eptano e il carbonile chetonico sono stati trovati anche mancanti nello spettro di 13 C-NMR. Ciò ha suggerito la riduzione del carbonile C-3, la perdita idrolitica della catena di eptanoato e l’aggiunta di un OH a C-14 (Tabella 1). Il gruppo OH è stato posto a C-3 sulla base delle correlazioni HMBC di H3-20 (Δ 0.91, d) con C-3 (Δ 71.4) (Figura 3). Ciò è derivato dalla riduzione del carbonile C-3. Il secondo gruppo OH è stato collocato a C-14, in base alla correlazione HMBC di H3-18 (Δ 0.81, s) con C-14 (Δ 84.8). Il terzo OH era al C-17, derivava dalla perdita idrolitica di porzione eptanata. Il gruppo O-H a C-3 è stato dedotto come orientato a α in base alle correlazioni NOESY di H-3 (Δ 3.69, br. s) con H-2 orientato a β (Δ 1.64, sovrapposizione) e Hormed α H3-20 (Δ 0.91, d) (Figura 4). L’OH-14 è stato dedotto come orientato a α, basato su correlazioni di NOESY di H-9 (Δ 1.32, m) con OH-14 (Δ 2.66, s) (acetone-d6). L’analisi di diffrazione dei raggi X a cristallo singolo ha ulteriormente supportato la struttura del metabolita 2, composto da tre anelli nella conformazione della sedia (a, b e c) e uno in conformazione avvolgente (d). Sono stati assegnati tre gruppi OH a C-3, C-14 e C-17, α-, α- e β-orientamento (Figura 5). Dati di diffrazione a cristallo singolo del metabolita 2 è stato inviato alla raccolta di dati cristallografici di Cambridge (CCDC 1500706). La struttura del metabolita 2 è stato quindi dedotto come 2α-metil-3α, 14α, 17β-trihidrossi-androstane.

Figura 3. Le correlazioni chiave HMBC () e Cozy () nei nuovi metaboliti.

Figura 4. CHIAVE CORRELAZIONI NOESY in nuovi metaboliti.

Figura 5. Disegno ORTEP generato dal computer del modello di raggio X finale del composto 2. Codici a colori: carbonio, nero; idrogeno, bianco; ossigeno, rosso.

Metabolita 3 è stato ottenuto come un solido bianco. L’HREI-MS ha mostrato il [M +] a m/z 318.2192 (calcd. 318.2195, c20H30O3). Ciò rappresentava la perdita della catena laterale eptanata e l’aggiunta di un atomo di ossigeno nel substrato 1. Lo spettro IR ha mostrato assorbanze per OH (3.436 cm −1) e carbonili chetonici (1.711 cm −1). Nello spettro 1 H-NMR, sono stati trovati segnali di catena eptanaato e protone di methine C-17, mentre è stato osservato un nuovo segnale di protone di methine a basso.92 (Tabella 1) (Scheda dati 3). Ciò ha suggerito l’idrossilazione dello scheletro steroideo e la scissione ossidativa della porzione eptanata. Lo spettro di 13 C-NMR ha anche supportato le inferenze di cui sopra. Sono stati trovati segnali di carbonio per la porzione di eptanoato, mentre un nuovo carbonile chetonico e un segnali di ossia-metina sono apparsi in 13 c-NMR (Tabella 1). Ciò indicava la scissione ossidativa della catena di eptanoato e l’idrossilazione nel substrato 1. Il nuovo protone di methine è apparso a Δ 3.92 (H-7) hanno mostrato correlazioni HMBC con C-5 e C-8, suggerendo un OH a C-7 (Figura 3). Le correlazioni HMBC di H3-18 e h2-16 con un carbonio a Δ 223.8 ha suggerito un carbonio chetonico a C-17. OH al C-7 è stato ulteriormente supportato da accoglienti correlazioni di H-7 con H2-6 e H-8. H-7 (Δ 3.92, s) ha mostrato correlazioni di Noesy con assialmente Oriente H-8 (Δ 1.70, sovrapposizione), che ha suggerito un orientato α di OH a C-7 (Figura 4). Pertanto, la struttura del metabolita 3 è stato dedotto come 2α-metil-7α-idrossi-5α-androstan-3,17-dione.

Metabolita 6, Un solido bianco, mostrava il [M +] negli hrei-MS a m/z 314.1897 (calcd. 314.1882, c20H26O3), a causa della perdita della catena laterale eptanaato, dell’aggiunta di un atomo di ossigeno e della perdita di cinque atomi di idrogeno nel substrato 1. Lo spettro IR ha mostrato assorbanze per OH (3.436 cm −1), chetone (1.736 cm −1) e Enone carbonile (1.661, 1.621 cm −1). I segnali di 1 H-NMR per i protoni eptani sono stati trovati mancanti, mentre il nuovo olefinico (Δ 7.69, s; 6.05, s) e un ossimetino (Δ 4.05, TD) sono apparsi protoni (Tabella 2) (scheda tecnica 6). Sono stati trovati anche segnali di carbonio per la catena dell’eptanoato, mentre un nuovo carbonio carbonilico chetonico (Δ 223.0), un carbonio ossia-metina (Δ 68.2) e quattro carboni olefinici (Δ 158.0, 131.3, 124.3, 171.7) è apparso nello spettro 13 C-NMR (Tabella 2). Ciò indicava l’idrossilazione dello scheletro steroideo, insieme all’idrolisi ossidativa della porzione di estere eptanoato e alla formazione di doppi legami nel substrato 1. Una C = C è stata posizionata tra C-1/C-2, in base alle correlazioni HMBC di H3-19 e h3-20 con carbonio olefinico di nuova formazione a Δ 158.0 (C-1), mentre un altro C = C è stato posizionato tra C-4/C-5, in base alle correlazioni HMBC di H3-19 con un altro carbonio olefinico appena formato a Δ 171.7 (C-5) e H-1 con carbonio olefinico a Δ 124.3 (C-4) (Figura 3). La posizione di OH-11 è stata dedotta attraverso le correlazioni HMBC di H-12 e H-9 con carbonio di methine di nuova formazione a Δ 68.2 (C-11). OH al C-11 è stato ulteriormente supportato da accoglienti correlazioni di H-11 con H2-12 e H-9. Il carbonio carbonilico chetonico appena formato è stato collocato a C-17, in base alle correlazioni HMBC di H3-18 e h2-16 con carbonio appena formato a Δ 221.4 (C-17). Correlazioni Noesy di H-11 (Δ 4.05, TD) con assialmente Oriente H-8 (Δ 1.93, m), h3-18 (Δ 0.96, s) e h3-19 (Δ 1.33, sovrapposizione) ha suggerito un gruppo OH ad Alpha (Figura 4). Pertanto, sulla base delle osservazioni di cui sopra, la struttura del composto 6 è stato dedotto come 2-methylandrosta-11α-hydroxy-1,4-diene-3,17-dione.

Metabolita 7, Un solido bianco, mostrava il [M +] negli hrei-MS a m/z 314.1861 (calcd. 314.1882, c20H26O3), a causa della perdita della catena laterale eptanaato, dell’aggiunta di un atomo di ossigeno e della perdita di cinque atomi di idrogeno nel substrato 1. Lo spettro IR ha mostrato assorbanze per OH (3.468 cm −1), chetone (1.727 cm −1) e Enone carbonile (1.666, 1.628 cm −1). I segnali di 1 H-NMR per i protoni eptani sono stati trovati mancanti, mentre nuovi protoni olefinici (Δ 7.05, s; 6.05, s) è apparso (Tabella 3) (scheda tecnica 7). Sono stati trovati anche segnali di carbonio per la catena dell’eptanoato, mentre un nuovo carbonio carbonilico chetonico (Δ 223.0), un carbonio ossia-metina (Δ 84.7) e quattro carboni olefinici (Δ 153.8, 134.6, 123.7, 171.9) è apparso nello spettro 13 C-NMR (Tabella 3). Ciò ha suggerito l’idrossilazione dello scheletro steroideo, insieme all’idrolisi ossidativa della porzione di estere eptanoato e alla formazione di doppi legami nell’anello A. Una C = C è stata posizionata tra C-1/C-2, in base alle correlazioni HMBC di H3-19, h3-20 e H-4 con carbonio olefinico appena formato a Δ 153.8 (C-1), mentre un altro C = C è stato posizionato tra C-4/C-5, in base alle correlazioni HMBC di H3-19 e h2-6 con un altro carbonio olefinico appena formato a Δ 171.9 (C-5) e H2-6 con carbonio olefinico a Δ 123.7 (C-4) (Figura 3). Il gruppo OH è stato posto a C-14, in base alle correlazioni HMBC di H2-16 e H-9 con carbonio di methine di nuova formazione a Δ 84.7 (C-14). Il carbonile chetonico appena formato è stato collocato a C-17, in base alle correlazioni HMBC di H3-18 e h2-16 con carbonio appena formato a Δ 223.0 (C-17). L’OH-14 è stato dedotto come orientato a α, in base alle correlazioni di NOESY di H-9 (Δ 1.35, m) con OH-14 (Δ 2.72, s) (acetone-d6) (Figura 4). Pertanto, sulla base delle osservazioni di cui sopra, la struttura del composto 7 è stato dedotto come. 2-methylandrosta-14α-hydroxy-1,4-diene-3,17-dione.

Metabolita 8, Un solido bianco, mostrava il [M +] negli hrei-MS a m/z 316.2042 (calcd. 316.2038, c20H28O3), a causa della perdita della catena laterale eptanaato, dell’aggiunta di un atomo di ossigeno e della perdita di tre atomi di idrogeno nel substrato 1. Lo spettro IR ha mostrato assorbanze per OH (3.417 cm −1), Enone (1.653 cm −1) e carbonile (1.736 cm −1). I segnali di 1 H-NMR per i protoni eptani sono stati trovati mancanti, mentre il nuovo olefinico (Δ 7.02, s) e protoni di ossimetina (Δ 3.93, s) è apparso nello spettro del metabolita 8 (Tabella 3) (Scheda dati 8). Sono stati trovati anche segnali di carbonio per la catena dell’eptanoato, mentre un nuovo carbonio carbonilico chetonico (Δ 223.4), un carbonio ossia-metina (Δ 66.7) e due carboni olefinici (Δ 155.6, 134.3) è apparso nello spettro 13 C-NMR (Tabella 3). Ciò ha suggerito l’idrossilazione dello scheletro steroideo, insieme all’idrolisi della porzione di estere ettatano e alla successiva ossidazione a C-17. Un nuovo C = C è stato posizionato tra C-1/C-2, in base alle correlazioni HMBC di H3-19 con carbonio olefinico di nuova formazione a Δ 155.6 (C-1) e H3-20 con carbonio olefinico a Δ 134.3 (C-2) (Figura 3). Il gruppo OH è stato posto a C-7, in base alle correlazioni HMBC di H-8 e H2-6 con carbonio di methine di nuova formazione a Δ 66.7 (C-7). OH al C-7 è stato ulteriormente supportato da accoglienti correlazioni di H-7 con H2-6 e H-8. Il carbonio carbonilico chetonico appena formato è stato dedotto in C-17, come dedotto dalle correlazioni HMBC di H3-18 e h2-16 con carbonio appena formato a Δ 223.4 (C-17). Correlazioni NOESY di H-7 (Δ 3.93, s) con assialmente Oriente H-8 (Δ 1.72, sovrapposizione) (Figura 4). Pertanto, sulla base della discussione di cui sopra, la struttura del composto 8 è stato dedotto come 2-metil-5α-androsta-1-ene-3,17-dione.

Metaboliti 4, 5, e 9 sono stati identificati come metaboliti noti, i.e., 2α-metil-3α, 17β-diidrossi-5α-Androstane (4) (Foglio di dati 4), 2-methylandrosta-1,4-diene-3,17-dione (5) (Scheda dati 5) e 2-metil-17β-idrossi-5α-Androstane-3-one (9) (Scheda dati 9), confrontando i dati spettrali con i dati precedentemente riportati. Metabolita 4 è stato precedentemente riportato da Fragkaki et al. attraverso il metabolismo nel corpo umano (Fragkaki et al., 2009). Mentre metabolita 5 è stato precedentemente riportato da Numazawa et al. Attraverso la modifica chimica di 2-metil-4-androstene-3,17-dione (Nimazawa et al., 2004). Allo stesso modo, metabolita 9 (Drostanolone) è stato anche ottenuto attraverso la biotrasformazione del composto 1. Il drostanolone è stato usato come materiale di partenza per la sintesi del drostanolone propionato e drostanolone enanthate (1) e altri derivati.

Sono state condotte anche analisi di diffrazione dei raggi X a cristallo singolo su composti 1, e 5. Composto 1 era composto da quattro anelli I.e., A, B, C e D con sedia, sedia, sedia e conformazioni di busta. Un metil era presente in C-2 con equatoriale orientamento. La catena di esteri eptanoato era presente al C-17 dell’anello D (Figura 6). Considerando che il metabolita 5 Contiene gli anelli A, B, C e D in pianta, sedia, sedia e conformazioni avvolgenti. La catena laterale eptanoato era assente nel metabolita 5 (Figura 7). Dati di diffrazione a cristallo singolo dei metaboliti 1, e 5 sono stati presentati alla raccolta di dati cristallografici di Cambridge (CCDC 1500705 e CCDC 1500707, rispettivamente). Dati di analisi della diffrazione dei raggi X a cristallo singolo dei composti 1, 2, e 5 è presentato nella Tabella 4.

Figura 6. Disegno ORTEP generato dal computer del modello di raggio X finale del composto 1. Codici a colori: carbonio, nero; ossigeno, rosso.

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